I cosmetici sono una categoria di prodotti di largo consumo e distribuzione, la cui produzione è sempre soggetta a linee guida specifiche. Infatti, i prodotti di bellezza vengono applicati direttamente sulla pelle e su altre aree sensibili; è necessario quindi garantire che non ci siano possibilità di reazioni avverse dovute alla presenza di organismi patogeni, anche in caso di esposizione prolungata.
Più in particolare, i produttori di cosmetici sono tenuti a rispettare i principi delle Linee Guida sulle Buone Pratiche di Fabbricazione (GMP), riportate nello standard DS/EN ISO 22716:2007 dell'Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione (ISO), che regola tutti gli aspetti della produzione, del controllo, dello stoccaggio e della spedizione dei cosmetici [2,3,4,5,6]. L'obiettivo principale di queste linee guida è quello di definire dei criteri per i prodotti cosmetici volti a garantire la sicurezza e la protezione del consumatore [2,3,4,7].
Secondo le GMP, i prodotti cosmetici non devono essere necessariamente sterili, ma non devono contenere organismi nocivi né patogeni. Può quindi essere presente una popolazione microbiologica bassa, ma stabile, che non interferisce nel corso della vita del prodotto.
Per soddisfare le condizioni richieste, sono obbligatorie le analisi di controllo qualità dei cosmetici e, in particolare, le analisi microbiologiche delle materie prime, dei prodotti sfusi e finiti, degli imballaggi, del personale, delle attrezzature e dei locali di preparazione e stoccaggio.
Inoltre, i produttori devono fornire informazioni a sostegno della stabilità microbiologica dei prodotti, essenziali per dimostrarne la stabilità complessiva durante il ciclo di vita.
Per questo vengono svolte le analisi di rischio microbiologico, necessarie per individuare la presenza di agenti patogeni e microrganismi opportunistici: poiché tali batteri sono molto dannosi, la loro presenza deve essere valutata dal produttore e soddisfare le normative per l'uso specifico previsto.
Tuttavia, possono essere oggetto di studio non solo microrganismi dannosi, ma anche quelli benefici. Infatti, nell’ultimo periodo, il mercato della produzione cosmetica ha visto l’affermarsi di una nuova tendenza: l’utilizzo di probiotici o batteri buoni allo stato vivo, o come fermenti o lisati come ingredienti, nei prodotti cosmetici.
In questo caso la presenza di microrganismi nella formulazione del cosmetico è fondamentale; pertanto, la valutazione del controllo di qualità si concentrerà su altri aspetti come, per esempio, la caratterizzazione della loro vitalità.
Oggi, la procedura di riferimento nella valutazione dei contaminanti microbiologici e nel controllo di qualità dei cosmetici è il metodo della conta su piastra. I campioni da analizzare vengono incubati su diversi terreni e in diverse condizioni, secondo i metodi ISO o della Farmacopea armonizzata. Il numero di agenti patogeni vitali presenti è determinato dalla conta su piastre di agar.
Si tratta però di un approccio che richiede diversi giorni di lavoro e una quantità elevata di batteri per poter effettuare una corretta valutazione, oltre a dipendere fortemente dall'operatore. A causa di ciò , il test può essere eseguito molto meno frequentemente e non è applicabile a tutte le fasi della produzione, causando dei limiti alle procedure di controllo qualità dei cosmetici.
Proprio per queste ragioni, la richiesta di metodi più sensibili che consentano di ottenere risultati in tempi più rapidi è in aumento da parte degli operatori del settore.
La risposta a questa esigenza può arrivare dalle tecnologie molecolari, che consentono di eseguire test più approfonditi e sensibili rispetto alle colture tradizionali e rappresentano quindi oggi una delle frontiere della microbiologia [8,9,10,11].
Da qui nasce lo studio del laboratorio di Controllo Qualità di Biofarma Group, volto a elaborare un innovativo metodo per il rilevamento molecolare finalizzato all’analisi del DNA batterico come indicatore di qualità dei cosmetici.
Per Biofarma Group l’innovazione continua è sinonimo di qualità costante. Per questo è da sempre alla ricerca di nuovi metodi per garantire il rilascio di prodotti di qualità, in conformità con le normative vigenti. Il Gruppo vanta infatti un laboratorio di Controllo Qualità all’avanguardia, costantemente impegnato nella ricerca. Tra i suoi risultati spiccano in particolare i metodi innovativi messi a punto per la conta dei probiotici con il citofluorimetro e, per l’appunto, per la ricerca di patogeni nei cosmetici mediante l’utilizzo di qPCR.
In particolare, l'obiettivo principale di questo secondo studio è quello di fornire prove preliminari sull'applicazione di un approccio molecolare per estrarre e analizzare il DNA per il controllo di qualità dei cosmetici, aggirando così il metodo delle piastre.
Nello specifico, nel corso dello studio è stato innanzitutto ottimizzato un metodo efficiente per l'estrazione del DNA batterico da matrici cosmetiche. Successivamente, sono state sfruttate le potenzialità della metodologia qPCR per la rapida individuazione e caratterizzazione dei contaminanti microbiologici estratti, sia probiotici che patogeni.
Per la realizzazione dello studio sono stati contaminati un totale di sei campioni di cosmetici caratterizzati da diverse composizioni di ingredienti naturali, aminoacidi, conservanti e altri eccipienti e da diverse forme fisiche come acquosa, compatta allo stato solido, oleosa, cremosa e lattiginosa.
Per la contaminazione sono stati utilizzati tre diversi tipi di cellule: il batterio probiotico Gram positivo Lactobacillus rhamnosus, un ceppo commerciale di Escherichia coli rappresentativo di un patogeno Gram negativo e cellule di lievito Candida albicans.
Il DNA è stato quindi estratto attraverso l’utilizzo di sette kit commerciali. Le sette metodologie selezionate avevano il vantaggio di sfruttare approcci diversi per la lisi cellulare: un kit basato sulle microsfere magnetiche, quattro kit basati sulla lisi meccanica delle cellule, due kit basati sulla digestione enzimatica della membrana.
I sette metodi hanno mostrato differenze significative nella resa e nella purezza del DNA prelevato. Le concentrazioni di DNA più elevate sono risultate dai metodi di battitura delle sfere, mentre i risultati più bassi sono stati ottenuti dai kit basati sulla digestione enzimatica della membrana.
Il materiale raccolto è stato poi analizzato tramite qPCR, un metodo che permette di sequenziare i caratteri genetici confrontandoli poi con una banca dati di riferimento al fine di individuare la presenza di patogeni nel prodotto cosmetico analizzato.
L’applicazione di questa innovativa tecnologia ha permesso di ottenere i risultati del rilevamento in quattro ore, consentendo una rapida valutazione sia delle materie prime sensibili alla contaminazione microbica che dei probiotici utilizzati come farmaci biologici, tranne nel caso della Candida albicans per cui saranno probabilmente necessari altri passaggi intermedi per aumentare il recupero del DNA o per rimuovere gli inibitori della qPCR.
È importante specificare che i metodi basati sul DNA non possono distinguere inequivocabilmente tra cellule vive e morte. Infatti, Il DNA delle cellule morte è indistinguibile dal DNA delle cellule viventi, il che può essere importante da considerare in determinati contesti. Infatti, senza l’identificazione selettiva dei microbi viventi, gli approcci al DNA sovrastimano i tipi e il numero di microrganismi vitali. Quindi, un risultato negativo dello screening segnala l'assenza di un agente patogeno specifico in un campione cosmetico, nel rispetto dei limiti microbiologici; un risultato di screening positivo richiede invece ulteriori indagini con tecniche diverse, per accertare la vitalità delle cellule individuate.
In conclusione, i risultati ottenuti dallo studio permettono di confermare che: combinata con l’estrazione meccanica, la qPCR può rappresentare un metodo efficiente e semplice per l’identificazione dei microrganismi nei cosmetici. Questo approccio è applicabile anche per il rilevamento dei probiotici utilizzati come componenti biologici benefici nei prodotti.
I risultati di questo metodo molecolare hanno quindi fornito evidenze preliminari per la rapida identificazione di cellule (10–100) e acidi nucleici in preparati complessi utilizzati per la salute umana, nel rispetto dei limiti normativi. La metodologia suggerita è un’assoluta novità nel campo del controllo qualità dei cosmetici: è semplice, veloce e sensibile e la sua scalabilità consente la valutazione microbiologica seriale in ogni fase della produzione.
Le parole di Emanuele Nencioni, QC Manager del gruppo Biofarma:
"L’innovazione in Biofarma si esplica in tantissimi campi, non solo nella produzione di integratori o cosmetici, ma anche nella continua ricerca di metodiche d’ analisi sempre piu’ performanti ed innovative.
Da anni nel laboratorio CQ in Biofarma nel sito di Mereto di Tomba, ho costituito un piccolo gruppo di ricerca che dedica passione, curiosità, conoscenza scientifica e tanta creatività atte a sviluppare competenze per le attività di nuove metodiche analitiche. Tante cose in questi anni sono state fatte:
Introduzione in laboratorio CQ di strumenti innovativi e all’avanguardia (Citofluorimetro, PCR Real Time)
Tante pubblicazioni scientifiche su riviste di settore a consolidare e ad accreditare le nostre attività a livello internazionale
Ma siamo un gruppo sempre alla continua ricerca di nuovi “campi” ancora inesplorati perche’ crediamo fermamente nella ricerca e nel continuo progresso scientifico."
A cura di:
Emanuele Nencioni, QC Manager
Michelutti, L.; Bulfoni, M.; Bolzon, V.; Nencioni, E. Preliminary Evidence of a Molecular Detection Method to Analyze Bacterial DNA as a Quality Indicator in Cosmetics. Cosmetics 2020, 7, 54.
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