Negli ultimi anni i probiotici sono diventati oggetto di un’intesa attività di ricerca. Questa attenzione è dovuta principalmente all’importante azione benefica che questi microorganismi svolgono sulla salute umana. Biofarma Group riconosce tale importanza e da anni è infatti attiva nella formulazione e produzione di integratori e farmaci a base di probiotici. Per poterne studiare e prevedere gli effetti è tuttavia necessario essere in grado di quantificarli in modo più esatto possibile.
Ecco perché un team di ricercatori composto da Luca Michelutti ed Emanuele Nencioni di Biofarma Group con il supporto della dott.ssa Michela Bulfoni dell’Istituto di Anatomia Patologica dell’ASU FC di Udine hanno effettuato uno studio in merito alla ricerca dei probiotici batterici tramite un nuovo metodo denominato citometria a flusso.
Prima di tutto è necessario chiarire che cosa sono i probiotici e a cosa servono.
I probiotici sono “batteri buoni” che, resistendo all’azione del succo gastrico e della secrezione biliare, sono in grado di insediarsi nell’intestino e contrastare così l’adesione di alcuni germi patogeni. La loro presenza non favorisce solo un equilibrio della flora batterica intestinale, ma influenza anche positivamente il sistema immunitario, riducendo nel contempo i livelli di colesterolo nel sangue e migliorando la sintomatologia delle allergie alimentari, oltre ad essere d’aiuto anche nel caso di diverticolosi, sindrome del colon irritabile e infezioni delle vie urinarie.
La loro importanza, inoltre, è riconosciuta in molti campi: farmaceutico, alimentare, idrico e ambientale.
In ambito farmaceutico, in particolare, saper quantificare il numero di probiotici vitali all’interno di una popolazione eterogena è fondamentale in quanto consente di comprendere il livello di efficacia di un prodotto sull’organismo umano.
Infatti, una caratteristica chiave dei probiotici è quella di essere metabolicamente attivi per poter proliferare ed esercitare i loro effetti benefici all’interno dell’intestino tenue e nel colon. Lo stato attivo, tuttavia, non è rilevabile tramite un metodo di misurazione tradizionale, poiché quest’ultimo fornisce solo informazioni sulla crescita microbiotica e sulla capacità di duplicazione dei microrganismi in vitro. Le cellule danneggiate e quelle quiescenti, invece, non possono essere rilevate correttamente e questo può essere causa di errori di quantificazione.
La soluzione che permette di ovviare a questo problema di misurazione è la citometria a flusso. Si tratta di una tecnica che permette di analizzare, quantificare e separare cellule o microparticelle. Nel caso specifico dei probiotici, è in grado di misurarne la vitalità e l’efficienza, analizzandone l’attività metabolica, la capacità di fermentazione, il potenziale di acidificazione e la capacità di assorbimento dell’ossigeno.
La tecnica citofluorimetrica prevede diverse fasi. Innanzitutto, si parte da un campione di cellule che viene sospeso in un fluido e trattato con coloranti specifici (fluorocromo) in grado di distinguere i sottotipi cellulari. Esso viene quindi inserito nello strumento chiamato, per l’appunto, citofluorimetro, viene incanalato nella camera di flusso e, successivamente, attraverso un foro molto stretto, le cellule proseguono in modo ordinato all’interno del tubo. Il flusso, quindi, viene intercettato da diversi rilevatori che analizzano tutte le cellule presenti all’interno a una velocità elevata, identificandone le caratteristiche chiave come, ad esempio, la dimensione o la complessità cellulare. Infine, il segnale intercettato dai vari rilevatori viene amplificato ed inviato al computer, che converte il risultato in un file digitale, solitamente sotto forma di grafici, che viene mandato in stampa.
Biofarma Group ha condotto uno studio per valutare i vantaggi derivanti dall’utilizzo di un metodo analitico basato sull’approccio citometrico a flusso.
Questa forma di analisi non viene solitamente applicata nel campo degli esami microbiologici, dove invece il più diffuso strumento per l’enumerazione batterica di routine rimane ancora la conta su piastra (Gracias e McKillip, 2004; Holm et al., 2004; Jozwa e Czaczyk, 2012).
Nello specifico, l’obiettivo dei ricercatori era quello di applicare i parametri ICH, normalmente utilizzati per l’analisi di farmaci e composti chimici, sui prodotti a base di probiotici, confrontando quindi il metodo classico con il nuovo test di vitalità.
Quasi tutti i valori statistici hanno confermato un’efficacia equivalente tra i due metodi confrontati. I risultati ottenuti dai prodotti finiti e dai campioni ricostituiti, infatti, hanno indicato una buona correlazione tra i conteggi su piastra e la citometria a flusso; inoltre, i dati relativi alla seconda sembravano essere replicabili con maggiore precisione e solidità.
Considerando tutti i risultati, l’ottimizzazione e la convalida della tecnica della citometria a flusso nel rispetto delle raccomandazioni ICH ha posto le basi per l’applicazione delle regole chimico-farmaceutiche anche nella conta dei probiotici, in quanto consente di identificare le cellule vitali e non vitali e fornisce ulteriori informazioni sul loro stato fisiologico e sulla loro attività metabolica.
Questa tecnica presenta inoltre ulteriori vantaggi: oltre a comportare costi inferiori, è stata osservata una sensibile riduzione del tempo di analisi, ovvero 2 ore rispetto ai 3 giorni richiesti dal metodo tradizionale, oltre al fatto che risulta possibile analizzare e quantificare migliaia di cellule attive anche in un campione molto piccolo.
Infine, l’applicazione di un approccio di validazione chimico-farmaceutica, utilizzando ICH su probiotici vitali, assicura un maggiore e più solido controllo di qualità nella citometria a flusso rispetto al metodo utilizzato abitualmente.
